Bei unterirdischen Reparaturarbeiten an einer Wasserleitung werden die Brooklyner Klempner Mario und Luigi plötzlich in eine geheimnisvolle Röhre gesaugt und landen daraufhin in einer magischen neuen Welt. Als die Brüder dort getrennt werden, begibt Mario sich auf eine gigantische Reise, um Luigi zu finden.

Mit der Unterstützung des Pilzkönigreichbewohners Toad und dank eines Trainings von Princess Peach, der willensstarken Herrscherin des Pilzkönigreiches, entdeckt Mario dabei ungeahnte Kräfte in sich.